фіксація матеріалу

• Навчально-методичні посібники з гістології. Під редакцією Васильєва Ю.Г. Соловйова А.А. Гурін О.Ю.

Методи виготовлення препаратів для світлової мікроскопії. Сутність і методи фіксації мікрооб'єктів, забарвлення препаратів.

Основним об'єктом дослідження є гістологічні препарати, приготовлені з фіксованих структур. Препарат може являти собою мазок (наприклад, мазок крові, кісткового мозку, слини, цереброспинальной рідини та ін.), Відбиток (наприклад, селезінки, тимуса, печінки), плівку з тканини (наприклад, сполучної або очеревини, плеври, м'якої мозкової оболонки) , тонкий зріз. Найбільш часто для вивчення використовується зріз тканини або органу. Гістологічні препарати можуть вивчатися без спеціальної обробки. Наприклад, приготований мазок крові, відбиток, плівка або зріз органу можуть відразу розглядатися під мікроскопом. Але внаслідок того, що структури мають слабкий контраст, вони погано виявляються в звичайному світловому мікроскопі і потрібне використання спеціальних мікроскопів (фазово-контрастні і ін.). Тому частіше застосовують спеціально оброблені препарати.

Процес виготовлення гістологічного препарату для світлової та електронної мікроскопії включає наступні основні етапи:

1) взяття матеріалу і його фіксація, 2) ущільнення матеріалу, 3) приготування зрізів, 4) фарбування або контрастування зрізів.

Для світлової мікроскопії необхідний ще один етап - укладання зрізів в бальзам або інші прозорі середовища.

Фіксація отриманого гістологічного матеріалу

це вплив на нього хімічними речовинами, а також фізичними факторами, що перешкоджає подальшому руйнуванню тканин об'єкта, зберігає його структуру.

Фізичні фіксують чинники - заморожування (твердої вуглекислотою, в рідкому азоті, кисні і т.д.), вплив високої температури, рентгенівське випромінювання. Всі ці фактори викликають загибель бактерії і інактивують власні ферменти тканин, сприяючи збереженню гістологічного матеріалу.

Хімічні фіксатори також викликають загибель мікробів і власних ферментів тканин, стабілізують структуру об'єкта. Разлічаютпростие і складні хімічні фіксатори.

Прості фіксатори складаються з однієї хімічної речовини (наприклад, формалін, спирт, оцтова кислота та ін.). Ці фіксатори, однак, призводять до певних порушень структури гістологічного матеріалу.

Так, формалін викликає зморщування його, зменшення в розмірах. Оцтова кислота, навпаки, викликає набухання. Тому частіше застосовують складні фіксатори, в яких негативний вплив простих фіксаторів нівелюється. Наприклад, фіксатор ФСУ складається з 4 частин формаліну, 1 частини спирту і 0,3 частин оцтової кислоти. Цей фіксатор викликає досить незначні зміни структури об'єкта. Відомо безліч і інших складних фіксаторів.

Фарбування зрізів (в світловій мікроскопії) або напилення їх солями металів (в електронній мікроскопії) застосовують для збільшення контрастності зображення окремих структур при розгляданні їх під мікроскопом. Методи забарвлення гістологічних структур дуже різноманітні і вибираються в залежності від завдань дослідження.

Гістологічні барвники поділяють на кислі, основні і нейтральні. Як приклад можна привести найбільш відомий основний барвник АЗУР II, який забарвлює ядра в фіолетовий колір, і кислий барвник - еозин, що забарвлює цитоплазму в рожево-оранжевий колір. Виборча спорідненість структур до певних барвників обумовлено їх хімічним складом і фізичними властивостями. Структури, добре забарвлюються кислими барвниками, називаються Оксифільні (ацидофільними, еозинофільними), а забарвлюються основними - базофільними. Структури, що сприймають як кислі, так і основні барвники, є нейтрофільними (Гетерофільні).

Пофарбовані препарати зазвичай зневоднюють в спиртах зростаючої фортеці і прояснюють в ксилолі, бензолі, толуолі або деяких маслах. Для тривалого збереження зневоднений гістологічний зріз укладають між предметним і покривним склом в канадський бальзам або інші речовини. Готовий гістологічний препарат може бути використаний для вивчення під мікро-

скопом протягом багатьох років. Для електронної мікроскопії зрізи, отримані на ультрамікротоме, поміщають на спеціальні сітки, контрастують солями марганцю, кобальту, та ін. Після чого переглядають під мікроскопом і фотографують. Отримані мікрофотографії служать об'єктом вивчення поряд з гістологічними препаратами.