Біотерапія, вакцинотерапію - імунотерапія в боротьбі з пухлинами

Вакцини в онкології - це біологічні препарати для активної імунопрофілактики та імунотерапії при злоякісних новоутвореннях, що містять пухлинні антигени. На їх введення система імунітету відповідає каскадом реакцій, які в кінцевому підсумку призводять до цілеспрямованого лизису пухлинних клітин. В даний час вакцинотерапію (Вт) є визнаним методом лікування багатьох видів злоякісних пухлин. ПВ здатні індукувати імунну відповідь як проти первинної пухлини, так і проти метастазів [7-9].

Профілактичні ПВ призначені для людей, що належать до так званих груп ризику. Їх дія спрямована на індукцію специфічної імунної відповіді, що попереджає розвиток пухлин, індукованих онкогенними вірусами. До профілактичних можна віднести вакцини проти вірусів гепатиту В і С (гепатокарціноми) [10, 11] і проти вірусів папіломи людини (рак шийки матки) [12, 13]. Терапевтичні ПВ створюються на основі пухлинних клітин (ОК) або конструюються з використанням ідентифікованих пухлиноасоційованих антигенів (ОАА). Профілактичне застосування вакцин цієї групи неможливо через численність різних видів пухлин і непередбачуваності їх появи, тому такі ПВ використовуються для лікування хворих з уже розвиненими злоякісними новоутвореннями [7, 9].

ПВ, призначені для клінічного застосування, повинні бути безпечними, ефективними проти широкого спектра пухлин одного гістологічного типу, а також давати відтворювані результати і зберігати стабільність властивостей при тривалому зберіганні [8, 14]. Важливим фактором, що визначає ефективність ПВ, є розмір пухлини, тому Вт доцільно проводити для профілактики рецидивів і метастазів після максимального зменшення пухлинної маси (хірургічного лікування) [7, 9]. Основну стратегію конструювання ПВ можна розглядати як виявлення мішеней імунної відповіді (ОАА), створення імуногенних форм і умов для розпізнавання таких антигенів, а також індукцію проліферації і підвищення активності сенсибілізованих імунокомпетентних клітин [10, 14]. Тому найбільш відповідальним етапом створення ПВ є вибір антигенів, що мають здатність стимулювати ефективні протипухлинні імунні реакції. Незважаючи на істотний прогрес в області ідентифікації ОАА, їх використання для конструювання ПВ пов'язане з деякими труднощами, головною з яких є те, що значна частина ОАА виявляється на певних стадіях диференціювання нормальних клітин в антенатальному і постнатальному періодах, тому до більшості цих антигенів організм толерантний [ 8, 9]. Труднощі також викликають способи індукції специфічної реакції імунної системи на ОК, особливо з урахуванням варіабельності біологічних властивостей пухлини (наявність клонів з різним потенціалом зростання і ступенем диференціювання), що часто супроводжується зміною експресії ОАА на кожному етапі розвитку пухлинного процесу [14, 15].

В даний час розроблена величезна кількість різноманітних ПВ, які можна розділити на дві основні групи [8, 14, 17]. Першу групу складають вакцини з цілих або лу аутологічних (клітини від хворого, для якого готується вакцина) або алогенних (від різних пацієнтів або з декількох клітинних ліній) ОК: модифікованих фізичними факторами (опромінення, заморожування - відтавання і ін.) [17, 18]; модифікованих за допомогою ад'ювант різної природи - хімічних (денітрофеніл, формалін) [19, 20], бактеріальних (БЦЖ, продукти синтезу Bacillus subtilis) [1, 12], вірусних (віруси коров'ячої віспи, хвороби Ньюкасла) [19]; модифікованих генами (ІЛ-2, ФНП, інтерферонів, ГМ-КСФ, костімулірующіх молекул, TAG7) [23-26].

Присутній широкий спектр ОАА визначає можливість використання таких ПВ при відповідній пухлини без оцінки експресії окремих антигенних детермінант. Вакцини цієї групи полівалентна і спочатку більш імуногенність, про що свідчать випадки втрати активності вакцин в міру їх очищення [7]. В останні роки інтерес до «цільноклітинним» вакцинам знову зріс, так як завдяки методам генної інженерії в ОК можна ввести нові гени антигенів або гени Цк, що підвищують їх імуногенність [17].

Друга група ПВ базується на генетично ідентифікованих ОАА і включає: очищені природні або рекомбінантні ОАА [14, 27]; синтетичні пептиди [18, 19]; ДНК [7, 13]; рекомбінантні віруси (аденовіруси, вірус віспи (vaccinia, avipox)) [10, 11] і бактерії (BCG і Lysteria) [9, 12]; білки теплового шоку [13]; антіідіотіпіческіе вакцини (на основі ідіотіпіческіх детермінант імуноглобулінів) [14] і т.п. Кожен варіант вищеперелічених ПВ може використовуватися для змішування, трансфекції або трансдукції антиген-презентірующих клітин або ж застосовуватися з різноманітними ад'ювантамі або Цк [7, 9, 13].

Деякі групи дослідників в якості альтернативи цільноклітинним і моновалентний антигенними вакцинам застосовують клітинні екстракти або напівочищення протеїни [19]. Наприклад, при меланомі використовуються секретуватися білки або фрагменти клітинної мембрани (великі полівалентні іммуногени) [9, 17]. В якості альтернативної вакцини також широко застосовуються шаперони, що несуть набори пептидів, включаючи пухлину-специфічні білки, виділені з аутологічних пухлин [7, 14]. Особливо перспективними кандидатами для вакцинотерапии пацієнтів з поширеними формами злоякісних пухлин, у тому числі і резистентними до стандартного лікування, є активовані ДК, які представляють лімфоцитам пептидні фрагменти ОАА в асоціації з молекулами комплексу гістосумісності (HLA) [9]. Перевагою таких вакцин є можливість індукції відповіді проти всіх антигенів, меющіхся в пухлини, без необхідності їх ідентифікації. Для навантаження ДК ОАА розроблені різні методи, включаючи навантаження синтетичними пептидами, пухлинними лізата, пухлинної РНК [17]. Ефективність дендритних-клітинних ПВ широко продемонстрована в експериментальних і клінічних дослідженнях [7, 9, 17, 18].

Одним з перспективних напрямків є розробка ПВ на основі дендритом, які отримують за допомогою гібридомної технології при злитті ОК і незрілих ДК. ДК в складі протипухлинних вакцин використовують спільно з пухлинними АГ в якості потужного ендогенного ад'юванта, який викликає індукцію специфічної імунної відповіді, опосередкованого ЦТЛ, в організмі реципієнта. ДК-вакцинотерапію відноситься до методів специфічної активної ІТ, на яку в даний час покладають великі надії. Стандартна процедура отримання вакцини включає генерацію незрілих аутологічних ДК шляхом інкубації їх попередників (CD34 + -клітин, моноцитів) з цитокінами в різних комбінаціях. Найбільш часто використовують: ГМ-КСФ + ІЛ-4 і ГМ-КСФ + ФНО-б. Проходять випробування такі фактори як ліганд Flt3, ліганд c-kit, TGF-в1 і CD40L. Потім незрілі ДК навантажують пухлинними АГ, інкубують з факторами, що індукують їх дозрівання (ЛПС, цитокіни ІЛ-1, ГМ-КСФ і ФНО-б та ін.), Потім функціонально повноцінні клітини реінфузіруют пацієнту [7, 8].

До основних властивостей ДК відносяться:

1) унікальна здатність збирати Т-клітини на своїй поверхні за рахунок найбільш високої експресії власних молекул головного комплексу гістосумісності II класу (HLA-DR, -DP і -DQ) і молекул I класу;

2) здатність при дозріванні експресувати молекули CD80, CD86 і CD40, які активують відповідні ліганди на Т-клітинах - CD28, CTLA-4 і CD40L;

3) здатність продукувати ряд цитокінів, включаючи інтерлейкін-12, який збільшує імунологічну відповідь за рахунок "напряму" Т-клітин шляхом диференціювання їх в Т-хелпери 1-ого типу;

4) здатність захоплювати розчинні антигени за допомогою ендоцитозу; 5) наявність ефективних механізмів для обробки (процесингу) складних білків до імуногенних пептидів;

Передбачається, що зменшення кількості ДК і втрата ними ряду функцій може бути однією з головних причин відсутності повноцінної імунної відповіді на розвивається пухлина. ДК належать до унікальних АПК, які поглинають АГ, процесує їх і представляють в комплексі з молекулами МНС І або ІІ у вторинних лімфоїдних органах для «ознайомлення» (праймінга) «наївних» Т-клітин або активації Т-клітин з властивостями натуральних кілерів (НКТ ) і НК-клітин.

ДК - дуже важлива сполучна ланка між природним і адоптівная імунітетом, здатним активувати первинний і вторинний імунну відповідь, індукувати розвиток імунологічної пам'яті 9-12]. На відміну від інших АПК, ДК володіють декількома додатковими механізмами, що дозволяють їм представляти АГ в комплексі не тільки з молекулами МНС II класу, а й МНС I класу, що є ключовим моментом для потужної генерації ЦТЛ, здатних инактивировать пухлинні клітини. Це так зване перехресне уявлення, коли АГ, зазвичай подаються молекулами МНС II класу, можуть бути представлені також і молекулами I класу [13, 14]. Одночасно запускається цитокіновий каскад та включається другий активаційний сигнал, опосередкований молекулами костімуляціі В7, які експресуються в великій кількості на поверхні зрілих ДК.

Два сигналу існують для того, щоб уникнути відповіді на свої АГ. У разі злоякісних новоутворень саме відсутність другого сигналу часто унеможливлює формування протипухлинного відповіді клітинами імунної системи. Виходячи з вищевикладеного, можна припустити, що можливими механізмами реалізації ефекту ДК-вакцинотерапии може бути забезпечення достатньої імуногенності пухлинних АГ; створення умов для їх ефективної презентації; подолання місцевої або системної імуносупресії [15, 16].

Існують різні методи отримання ДК-вакцин [17, 18, 19]: навантаження ДК пептидами АГ пухлин; рецепторопосредованного поглинання макромолекулярної АГ; трансфекція ДК РНК пухлини, кодує АГ, плазмідної ДНК, вірусними векторами; забезпечення взаємодії з некротізованнимі пухлинними клітинами або їх окремими фракціями, з апоптотичні пухлинними клітинами; освіту химер ДК з пухлинними клітинами; використання екзосом.

Все ще не припиняються спроби отримання універсальної ДК-вакцини проти широкого спектра пухлин. Для цих цілей необхідно здійснити вибір відповідного пухлинного АГ для «навантаження» ДК. Інтерес дослідників в цьому плані привернув пухлиноасоційованих АГ MUC-1, експресується на клітинах багатьох епітеліальних пухлин (рак підшлункової, молочної залози, рак нирки та ін.) І антигени, які кодуються такими генами, як MAGE, BAGE і GAGE, експресуються клітинами пухлин різних гістологічних типів, але відсутні в клітинах нормальних тканин; поліпептидний компонент теломерази - її каталітична субодиниця - зворотна транскриптаза (TERT), так як теломераза неактивна в нормальних тканинах, але реактивується більш ніж в 85% типів пухлин. ДК вже досить широко використовують для індукції і отримання великої кількості антигенспецифических Т-лімфоцитів (ЦТЛ) не тільки in vivo, а й in vitro [10, 11, 12]. При цьому повідомляється про досить високу частоту стабілізації або регресії пухлини або метастатичних вузлів, підвищення тривалості життя хворих онкологічного профілю після їх введення.

Ще однією досить серйозною проблемою ДК-вакцинотерапии є можливість індукції толерантності до пухлини в разі використання ДК з толерогенниє властивостями, особливо великий ризик при використанні клітин недостатній мірі зрілості [19]. Залишається також багато невирішених проблем, пов'язаних з методами виготовлення ДК-вакцин, вибором пухлинного АГ, конструюванням найбільш ефективних протоколів їх застосування з урахуванням режимів і способів введення, якості і кількості використовуваних клітин.

Залишається актуальним пошук методів моніторингу, зокрема імуномоніторингу проведеної ДК-вакцинотерапии, що дозволило б підходити до даного методу біотерапії пухлин на об'єктивній основі і прогнозувати успіх чи невдачу запропонованого виду лікування. Як показує накопичений клінічний досвід, для досягнення ефективності ДК-вакцинотерапии необхідні максимальне зменшення розмірів пухлини (ціторедуктівних операції, хіміо-, променева терапія), достатня Імунокомпетентності організму-пухлиноносія і одночасна активна неспецифічна імунотерапія: введення FLT-3L, ГМ-КСФ, низьких доз ІЛ-1,2,7,12, інтерферону-г, антитіл до CTLA-4, що дозволить посилити протипухлинний імунітет і запобігти реці-дів або віддалити його. Тим часом слід зазначити, що в процесі клінічних випробувань протипухлинні вакцини застосовували хворим лише на запущеній стадії захворювання і часто при відсутності успіху від стандартної терапії, тобто фактично в клініці ці вакцини досі повноцінно не апробовувалися. Багато випробування поки пройшли лише першу фазу і не включали контрольні групи. Можна припустити, що застосування протипухлинних ДК-вакцин буде більш ефективно у хворих із злоякісними новоутвореннями на ранніх стадіях процесу після проведення ціторедуктівних лікування і адекватних иммунокорригирующих заходів [11].

Вони зберігають потужний антиген-презентируют апарат ДК і здатні стимулювати цитотоксические лімфоцити з розвитком повноцінного протипухлинного відповіді [19]. Важливо, що презентація антигену Т-лімфоцитам відбувається в поєднанні з усім широким спектром костімулірующіх молекул, секретується ДК. Така стратегія дозволяє створювати ПВ на основі аутологічних ДК і алогенних ОК, охарактеризованих антигенним складом, тому немає необхідності типировать хворих і ОК по HLA. Результати експериментальних досліджень дозволили перейти до клінічного випробування дендрітомних вакцин, отримані результати I-II фази досліджень [16,18].

В Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України проведені масштабні дослідження з конструювання і вивчення ефективності ПВ, приготованих з аутологічних ОК за допомогою продуктів синтезу B. subtilis В-7025 [11, 18]. Провеени доклінічні і три фази клінічних досліджень ПВ - доведена ефективність застосування ПВ в комплексній терапії хворих на колоректальний рак [18], рак легені [11], шлунка [18, 19], молочної залози, яєчника, злоякісними пухлинами головного мозку [11]. В експериментальних і клінічних дослідженнях вивчено вплив ПВ на характеристики специфічного і неспецифічного ланок імунної системи. Сукупність отриманих результатів обґрунтовує застосування розробленої ПВ в комплексній терапії хворих онкологічного профілю.

онкологія біотерапія вакцина генотпрапія