Приготування гістологічних зрізів

Вивчення патологічних процесів на клітинному і тканинному рівні проводиться за допомогою мікроскопічних досліджень. Гістологічний метод дослідження необхідний для вивчення будови і функції клітин в стані норми, патології та експериментальному періоді. Для гістологічного дослідження беруться елементи тканин і органів. Товщина досліджуваного зразка не може перевищувати 1 см 3.

Зразки тканин можуть братися у людини відразу після смерті (чим швидше, тим краще) - аутопсия. Також матеріал може братися під час операції або безпосередньо в діагностичних цілях за допомогою спеціальних інструментів - біопсія.

приготування зразків

Приготування зразків відбувається в кілька етапів:

Фіксація матеріалу.
Приготування зрізу.
Процес фарбування зрізу.

Суть фіксації матеріалу полягає в зупинці природних процесів в тканинах і клітинах. Це необхідно для того, щоб під час купірувати процес гниття і ферментативні зміни в структурі тканин.

У фіксованих тканинах за рахунок фізико-хімічних процесів відбувається згортання (коагуляція) білків і ліпоїдному складової. Цей стан дозволяє тканинам довго зберігатися в незмінному вигляді, без реакції на різноманітні впливи. Простіше кажучи, фіксація тканин проводиться з метою збереження прижиттєвої структури біологічного матеріалу.

Для фіксації тканин застосовуються спеціальні рідини (фіксатори). Найбільш популярними фіксаторами можна назвати наступні варіанти рідин:

Вище перераховані прості фіксатори. Також для фіксації тканин застосовуються більш складні варіанти фіксаторів (розчини):

Спирт-формол.
Рідина Ценкера.
Двухромовоокіслий калій.

У списках вказані лише деякі види застосовуваних фіксаторів. Тривалість необхідного для фіксації зразків тканин періоду може варіюватися від декількох годин до доби. Тривалість залежить від особливостей досліджуваних зразків і типу обраного фіксатора. Після того як етап фіксації пройдений необхідно зробити промивання матеріалу (протягом декількох годин) в проточній воді. Це робиться для того щоб звільнити зразки від надлишків фіксує рідини і осадової суспензії.

Каламутні непрозорі зразки не підходять для дослідження. Такі шматочки матеріалу не дозволять отримати необхідну інформацію. Перед тим як приступити до одного з головних етапів - здійснення зрізу, зразки промиваються чистою водою протягом декількох годин. Далі, матеріал піддається процесу зневоднення. Зневоднення здійснюється за допомогою проведення тканинного зразка через спирти зростаючої фортеці. Цей етап тривалий. У кожному спирті шматочки матеріалу знаходяться від 2-3 годин до доби.

Після зневоднення проводиться заливка зразків. Цей етап необхідний для ущільнення тканин і отримання якісних блоків для дослідження. Ущільнення проводиться шляхом заморожування (термінова біопсія) або шляхом заливання парафіном або целлоидин. Заливка парафіном - досить тривала процедура (від 24 годин і довше). Такий варіант ущільнення зразків використовується для здійснення дослідження в звичайному режимі. Для кращої візуалізації окремих структур тканин зрізи забарвлюють. Для фарбування застосовують спеціальні гістологічні барвники (кислі, основні, спеціальні).

Підготовлені до вивчення зразки досліджують за допомогою спеціального мікроскопа.

Перш ніж приступити до вивчення гістологічного препарату необхідно переконатися, що останній повністю відповідає ряду обов'язкових вимог:

У матеріалі повинні бути збережені прижиттєві структури.
Зріз повинен бути тонким і прозорим.
Структури, які потрібно піддати вивченню повинні бути чітко візуалізовані за рахунок фарбування.
Препарати повинні мати тривалий термін зберігання.

При якісному приготуванні препарату досягти відповідності всім перерахованим вимогам досить просто. Однак не можна виключити можливість виникнення невеликих похибок. Якщо вчасно розпізнати деякі види неточностей, купірувати шлюб, створити якісний матеріал цілком можливо.

Найпоширенішими помилками при приготуванні зрізів можна назвати наступні варіанти:

Крошение зрізу.
Випадання матеріалу з парафіну та маси.
Неможливість нарізки матеріалу.
Розрив матеріалу.

Ті чи інші похибки можуть виникати з різних причин. Іноді в основі порушення якості зразка лежать помилки під час виготовлення. Для усунення кожної похибки передбачені певні алгоритми дій.

Методи гістологічного дослідження

Для здійснення мікроскопічного дослідження необхідні тонкі шматочки матеріалу. Ширина таких шматочків вимірюється в мікрометрів. Для зручності отримання таких зрізів використовуються спеціальні прилади - мікротоми. Конструкція цього приладу передбачає можливість отримання зрізів товщиною 5-10 мікрометрів.

Основним методом дослідження в гістології є мікроскопія. За допомогою мікротома можна виготовляти найтонші зрізи, які підходять для проведення мікроскопічних досліджень. Отримання зрізу відбувається за рахунок руху ножа в одному напрямку. Товщина зрізу задається на етапі спрацьовування механізму підйому.

Для виготовлення зрізів з матеріалу, залитого парафіном або целлоидин, використовують радіальний, ротаційний або санний мікротом.

Для отримання зрізу з рослинних або тваринних тканин можуть застосовуватися спеціальні заморожують мікротоми. Для мікроскопічного дослідження використовується кілька методів приготування зрізів. Для кожного з методів вибираються певні види мікротомів і застосовуються певні чіткі алгоритми дій.

Гістологічні зрізи бувають:

Можуть проводитися зрізи фіксованого та нефіксованого матеріалу. Все залежить від характеру досліджуваних тканин і основних цілей проведення зазначеного дослідження. Також в гістології існують інші методи приготування зрізів.

Мікротоми і їх застосування

Як вже було сказано вище, зрізи в гістології створюються за допомогою спеціального пристрою - мікротома. У самій назві закладено розшифровка призначення приладу - micros (маленький), tome (розсічення). Одним з найбільш використовуваних можна назвати санний мікротом.

Назва приладу походить від принципу роботи механізму, який базується на подачі ножа з затискачем за допомогою спеціальних санчат. Санний мікротом призначений для здійснення парафінових зрізів. Як правило, такий прилад працює з одноразовими лезами або касетами. Такий високоточний мікротом складається з станини, механізму мікроподачі, підйомного механізму, затискачів для блоків, ножедержателя.

Такий апарат дозволяє виготовляти зрізи товщиною від 0,5 до 60 мікрометрів. Санний мікротом відрізняється високоточної регулюванням товщини зрізу. Функція подачі матеріалу може бути механічною або ручною. Прилад призначений лише для здійснення рутинних досліджень в області медицини, ботаніки та біології.

Ротаційний мікротом - прилад з нерухомим ножем і рухомим столиком. У приладі передбачена моторизована подача зразка. Цей мікротом призначений для використання в гістологічної лабораторії для проведення досліджень, спрямованих на вирішення гістологічних та гістопатологічних завдань.

Для отримання зрізів з нефіксованих тканин або в тих випадках, коли необхідно термінове проведення дослідження використовуються заморожують мікротоми. Такі прилади забезпечені заморожуючим столиком, на якому і закріплюється досліджуваний зразок. Головним правилом успішного отримання гістологічного зрізу за допомогою мікротома є правильний вибір кута нахилу ножа і кута перетину. Найкращим кутом нахилу є той, при якому площина леза знаходиться паралельно верхній частині блоку.

Якщо вибрати кут нахилу більший, ніж потрібно, утворюється ризик, що зріз буде кришитися. При меншому куті нахилу лезо буде ковзати по поверхні матеріалу. Отримання необхідного результату при такому положенні ножа неможливо. Величина кута перетину залежить від характеру досліджуваного матеріалу. Чим зразок м'якше, тим менше буде кут різання. При обробці м'яких блоків непоганим варіантом вважається косе розташування ножа.

Різання на мікротому

Для приготування зрізів з парафінованих об'єктів або зразків, оброблених целлоидин, знову ж найчастіше використовують ротаційний мікротом.

Спочатку блок піддають обрізку. Це необхідно для усунення вільного парафіну або іншого ущільнювача. Якщо цю процедуру не справити, зріз може вийти нерівномірним, зморшкуватим і, як наслідок, малоінформативною. Також сморщивания можна уникнути за допомогою охолодження досліджуваного матеріалу.

Далі, парафіновий блок міцно закріплюється в затиску. Попередньо необхідно вивірити правильний кут розташування ножа і вибрати необхідний кут різання. Після цього потрібно використовуючи регулювання механізму подачі, встановити блок так, щоб його поверхня знаходилася від леза ножа на відстані 0,5-1 мм.

Після здійснення підгонки проводиться установка мікрометричною шкали для отримання перших товстих зрізів. Після цього проводиться моделювання блоку (зрізка надлишків парафіну, переказ прямокутної форми). Заключним етапом є виставлення мікрометричною шкали на задуману товщину і здійснення остаточної різання матеріалу.