Методи дослідження в гістології
Методи дослідження в гістології. Підготовка препаратів до мікроскопії.
Методи дослідження в гістології включають приготування гістологічних препаратів і їх вивчення за допомогою світлових або електронних мікроскопів. Гістологічні препарати є мазки, відбитки органів, плівкові препарати, тонкі зрізи шматочків органів, пофарбовані тим чи іншим барвником (досліджуються також нативні - нефарбовані зрізи), поміщені на предметне скло, укладені в бальзам і покриті тонким покривним склом.
Для виготовлення гістологічного препарату необхідно після взяття матеріалу зробити його фіксацію в тому чи іншому фиксаторе (формаліні, спирті, а для електронної мікроскопії - в Глутаровий альдегіди і чотириокису осмію). Робиться це для запобігання процесів аутолізу і збереження структури органу, близької до прижиттєвої. Далі йдуть етапи зневоднення шматочка органу в спиртах зростаючої концентрації і в ксилолі з метою ущільнення тканин, що необхідно для виготовлення тонких зрізів. Для додання шматочку органу ще більшої щільності і гомогенності, що забезпечує високоякісну різання, проводять його заливку в органічну середу - парафін, целлоидин (для світлової мікроскопії) і органічні смоли (Епон, аралдіт, дуркупан) - для електронно-мікроскопічного дослідження.
Існують також фізичні способи фіксації матеріалу. найбільш поширеним з яких є швидке заморожування шматочка органу за допомогою жідко.го азоту та інших засобів. Для різання замороженого матеріалу використовують спеціальні прилади - кріостати, або заморожують мікротоми.
Товщина зрізів, призначених для світлової мікроскопії. не повинна перевищувати 4-5 мкм, для електронної - 50-60 нм (такі ультратонкі зрізи виготовляють на спеціальному приладі ультратоме, використовуючи скляні або алмазні ножі і автоматичний режим різання).
Після отримання зрізів їх поміщають на предметне скло, далі йдуть етапи звільнення зрізів від заливальної середовища (при світловій мікроскопії) і забарвлення для додання зрізах контрастності. Серед гістологічних барвників найбільш часто вживається поєднання гематоксиліном, маркирующего ядро (кислотні молекули), і еозину, вибірково фарбувального білкові молекули (цитоплазматичний барвник).
Після закінчення фарбування зрізи укладають в консервуючі середовища (канадський, кедровий бальзами) і накриваються покривним склом.
Основним методом гістологічного дослідження клітин, тканин і органів є світлова мікроскопія. У світловому мікроскопі для освітлення об'єкта використовуються промені видимого спектру. Сучасні світлові мікроскопи дозволяють отримувати дозвіл близько 0,2 мкм (роздільна здатність мікроскопа - це те найменше відстань, при якому дві поруч розташовані точки видно як окремі). Різновиди світлової мікроскопії - фазово-контрастна, інтерференційна, поляризаційна, темнопольная і ін.
Фазовоконтрастна мікроскопія - метод вивчення клітин в світловому мікроскопі, обладнаному фазово-контрастним пристроєм. Завдяки зсуву фаз світлових хвиль в мікроскопі такої конструкції підвищується контрастність структур досліджуваного об'єкта, що дозволяє вивчати живі клітини.
Інтерференційна мікроскопія. У інтерференційному мікроскопі падаючі на об'єкт світлові пучки роздвоюються - один пучок проходить через об'єкт, інший - йде повз. При подальшому возз'єднання пучків виникає інтерференційне зображення об'єкта. За зрушення фаз одного пучка щодо іншого можна судити про концентраціях різних речовин в досліджуваному об'єкті.
Поляризаційна мікроскопія. У мікроскопах цього типу світловий пучок розкладається на два промені, поляризованих у взаємно перпендикулярних площинах. Проходячи через структури тканини з суворою орієнтацією молекул, промені запізнюються один щодо одного внаслідок неоднакового їх заломлення. Виникає при цьому зрушення фаз є показником подвійного променезаломлення клітинних структур (таким способом були досліджені, наприклад, міофібрили).