Гібридизація соматичних клітин
Роль ізольованих протопластів в селекції. Гібридизація соматичних клетокосуществляется методом злиття протопластів, ізольованих із соматичних клітин рослин, і застосовується для створення нових генотипів, нових форм рослин. Використання ізольованих протопластів дозволяє вирішувати безліч теоретичних і практичних завдань. З їх допомогою можна вести селекцію на клітинному рівні, працювати в малому обсязі з великим числом індивідуальних клітин, здійснювати пряме перенесення генів, вивчати мембрани, виділяти пластиди.
Протопласти неодмінно беруть участь в соматичної гібридизації. Термін «соматична гібридизація», що означає процес злиття протопластів соматичних клітин, був введений Дж. Мельхерсом в 1974 році.
Соматична гібридизація має важливі особливості. По перше. цього процесу доступні практично будь-які схрещування. По-втори х, злиття протопластів сприяє об'єднанню цитоплазматических генів батьківських клітин, чого не буває при схрещуванні статевих клітин.
Мимовільне злиття протопластів не відбувається, тому вченими, після тривалих досліджень, розроблено механізм цього процесу. Встановлено, що протопласти мають негативний поверхневий заряд, що викликає їх взаємне відштовхування. Для здійснення злиття це відштовхування навчилися долати спеціальними прийомами, що сприяють зняттю поверхневого заряду мембран. Вперше штучне злиття протопластів за допомогою індуктора злиття (фьюзогена) було здійснено в 1970 році Є. Коккінг. В даний час в якості ефективних фьюзогенов використовують поліетиленгліколь (ПЕГ) і розчини з рН 9-11 і високою концентрацією іонів кальцію. Механізм злиття протопластів при використанні ПЕГ полягає у високій концентрації цієї речовини (20-30%), що сприяє поглинанню всієї вільної води між протопластами, викликаючи їх злиття в результаті дегідратації. Крім того, поглинання вільної води індукує утворення пір в мембрані, через які перетікає внутрішньоклітинний вміст. Пошкодження мембран оборотні, тому що злилися протопластів регенерують клітинну стінку (рис. 4.1). Крім того, існує фізичний фактор активізації впливу на мембрани - імпульси електричного струму, які також змушують протопластів зливатися. Обробка електричними імпульсами, як і обробка ПЕГ, призводить до оборотного пошкодження мембран. Застосування змінного струму викликає діелектрофорез, і протопластів, що знаходяться між електродами, шикуються в ряд, приєднуючись один до одного своїми полярними поверхнями. Імпульс постійного струму призводить до утворення пір, через які відбувається злиття (рис. 4.2).
При соматичної гібридизації розвиваються клітини двох типів: гібриди і цибріди.
Мал. 4.1.Сліяніе протопластів під дією поліетиленгліколю
1 - ізольовані протопласти; 2 - злиття протопластів в результаті дегідратації; 3 - утворення пор в мембрані протопласта; 4 - перетікання через пори внутрішньоклітинного матеріалу; 5 - гібридний протопласт
Мал. 4.2.Сліяніе протопластів під дією електричного струму
1 - ізольовані протопласти; 2 - злиття протопластів полярними поверхнями; 3 - утворення пір в мембранах під впливом сильного імпульсу постійного струму; 4 - змішування цитоплазми; 5 - освіту гібридних протопластов
При утворенні гібридів об'єднується ядерний геном обох клітин. Цибридних клітина містить цитоплазму обох партнерів, а ядро - одного. Такий результат досягається при деградації одного з ядер після злиття або в тому випадку, якщо один з протопластів був позбавлений ядра.
Перший нестатевий гібрид вищих рослин було отримано в 1972 році при злитті ізольованих протопластів двох видів тютюну: Nicotiana glauca і Nicotiana langsdorfii. В даний час отримано багато міжвидових і межсемейственних гібридів, значну частину яких можна вважати нормальними рослинами, а деякі гібриди (гібрид арабидопсиса і турнепсу) представляють собою рослини - монстри. Виникаючі аномалії - результат хромосомної незбалансованості. Описані випадки виникнення гібридів між протопластами еритроцитів щура і дріжджових клітин, моркви і людини та ін.
Будь-які дослідження, будь-які маніпуляції в області створення нових генотипів повинні бути ретельно і всебічно продумані, а вчені повинні пам'ятати про відповідальність і наукової етики. Професор Колумбійського університету Е. Чаргафф попереджав про те, що «в тисячі дослідів, ймовірно, нічого не трапиться, але потім в одному якомусь випадку відбудеться щось дуже неприємне». Він був «переконаний, що саме спроба перетворити або перехитрити природу колись приведе її до загибелі».
ОТРИМАННЯ ЕМБРІОНІВ IN VITRO. Кріоконсервації. ТРАНСПЛАНТАЦІЯ ЕМБРІОНІВ